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技術(shù)文章

人腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)ELISA試劑盒使用說明書

閱讀:354發(fā)布時間:2010-3-29

人腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍:78 pg/ml - 5000 pg/ml

zui低檢測限:19.5 pg/ml

特異性:本試劑盒可同時檢測天然或重組的人iFABP,且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期:6個月

預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中iFABP含量。

說明

1.試劑盒保存:-20(較長時間不用時);2-8(頻繁使用時)。

2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。

4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗iFABP抗體的微孔中依次加入標本或標準品、*化的抗iFABP抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的iFABP呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96孔)。

2.         標準品Standard):2凍干品。

3.         樣品稀釋液(Sample Diluent1×20ml/瓶。

4.         *標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent1×10ml/瓶。

5.         辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 HRP-avidin Diluent1×10ml/瓶。

6.         *標記抗體(Biotin-antibody1×120μl/瓶(1100

7.         辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin1×120μl/瓶(1100

8.         底物溶液(TMB Substrate1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液(Wash Buffer1×20ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液(Stop Solution1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

 

需要而未提供的試劑和器材

1.         標準規(guī)格酶標儀

2.         高速離心機

3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.         干凈的試管和Eppendof

5.         系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,一次檢測樣品較多時,用多通道移液器

6.    蒸餾水,容量瓶等

標本的采集及保存

1.         血清:全血標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?/span>-20-80保存,但應(yīng)避免反復凍融。

2.         血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘,或將標本放于-20-80保存,但應(yīng)避免反復凍融。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本:1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?/span>-20-80保存,但應(yīng)避免反復凍融。

注:標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

標本的稀釋原則:

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi),檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中,應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度時,稀釋了“N”倍,標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標準品的稀釋原則:2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為5000 pg/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋5000 pg/ml,2500 pg/ml,1250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,156 pg/ml,78 pg/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制2500 pg/ml標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml5000 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

*標記抗體的稀釋原則:

臨用前以*標記抗體稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl*標記抗體加990μl*標記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則:

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。

操作步驟

實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓?/span>加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液 100μl(取1μl*標記抗體加99μl*標記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。

4.         每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同*標記抗體工作液) 100μl,37℃60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔顯色不明顯,即可終止)。

7.         依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

1. 用戶在初次使用試劑盒時,應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8℃保存。標準品、*標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。

5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

 

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