深度測序深入剖析人類機(jī)體整套免疫系統(tǒng)的功能

從研究者Susumu Tonegawa（利根川進(jìn)）及同事發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的抗體多樣性秘密到現(xiàn)在已經(jīng)過去40多年了；早在1978年，日本科學(xué)家Tonegawa就通過利用相對較低分辨率的工具發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞可以從大量收集的可變（V）、多樣性（D）及連接（J）基因片段中有效地選擇一個(gè)來產(chǎn)生功能性的抗體基因，同時(shí)研究者還可以通過剔除插入到基因組中的DNA來將上述基因片段連接起來，而這被稱之為體細(xì)胞重組。

研究者Susumu Tonegawa因“發(fā)現(xiàn)抗體多樣性的遺傳學(xué)原理”獲得了1987年的諾貝爾學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，然而細(xì)胞如何行使這些基因組操作工作依然是個(gè)謎題，如今非常感謝新一代的DNA測序技術(shù)使得這些機(jī)制重新被科學(xué)家們所關(guān)注，同時(shí)表觀遺傳學(xué)信號(hào)似乎也會(huì)影響偏遠(yuǎn)基因組元件的成環(huán)和重排的能力。

在一項(xiàng)研究中，來自英國巴布拉漢研究所(Babraham Institute)的研究人員Anne Corcoran和其同事就利用了一種名為VDJ-Seq的方法，結(jié)合高通量測序技術(shù)ChIP-seq及其它測序技術(shù)揭示了VDJ重組事件中V基因使用背后的表觀遺傳因素；VDJ重組即H鏈可變區(qū)的D基因的任一段與J基因拼成DJ基因后再與V基因任一段相結(jié)合而形成新基因的過程。

此外，來自伊利諾伊大學(xué)的研究者Amy Kenter又利用染色體構(gòu)象俘獲（3C）的高通量突變體解析了免疫球蛋白區(qū)域的染色體架構(gòu)信息；上述這兩項(xiàng)研究表明，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及染色體構(gòu)象在機(jī)體全部免疫系統(tǒng)形成中的復(fù)雜重要角色。

VDJ-Seq方法的圖表

遺傳偏差

小鼠的免疫球蛋白重鏈區(qū)包含了195個(gè)V基因，10個(gè)D基因以及4個(gè)J基因，其跨越了3Mb長度的基因組DNA，這些基因片段可以隨機(jī)重組產(chǎn)生7800種基因組合方式，而且，每個(gè)重組片段中的隨機(jī)核苷酸插入以及剔除，輕鏈基因，諸如體細(xì)胞高頻突變等機(jī)制以及抗體產(chǎn)生的數(shù)量都會(huì)呈指數(shù)形式增長，然而基因的使用或許并不是*隨機(jī)的，有些V基因相比其它基因而言卻會(huì)非常頻繁地發(fā)生重組。

研究者Corcoran推測了隱藏在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及其它表觀遺傳改變背后的結(jié)果，他表示，雖然VDJ-Seq技術(shù)在不斷變革，但他們意識(shí)到必須擁有大量的表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)才能夠在較大的免疫球蛋白區(qū)域進(jìn)行繪圖，但如今研究者并不清楚上述過程中每個(gè)基因使用的頻率如何。

VDJ-Seq技術(shù)基于引物眼神到了J區(qū)域，所以該技術(shù)可以覆蓋DNA中重組的VDJ基因組序列區(qū)域，通過捕獲來自小鼠早期階段祖B細(xì)胞(pro B cells)中的DNA，并且對相應(yīng)片段進(jìn)行測序；研究者指出，在小鼠被感染之前或暴露于病原體之前，這種新技術(shù)就可以對其機(jī)體一系列基因的使用情況進(jìn)行大范圍的普查。

在小鼠免疫球蛋白重鏈基因去的195個(gè)V基因中，128個(gè)基因都會(huì)發(fā)生頻繁重組（活性狀態(tài)），而67個(gè)基因則不會(huì)重組（失活狀態(tài)）；為了理解活性和非活性基因區(qū)域間的差異，研究小組將V基因的使用數(shù)據(jù)同18個(gè)表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（包括ChIP-seq和非編碼轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫）相互關(guān)聯(lián)，從而尋找可以預(yù)測基因重組的相關(guān)因子，zui后研究者鑒別出了兩種表觀遺傳學(xué)標(biāo)記：A和E，這兩種標(biāo)記同活性重組之間存在一定關(guān)聯(lián)，兩者并沒有參與種系的轉(zhuǎn)錄，研究者意外發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)錄或許會(huì)被認(rèn)為在重組中扮演重要角色，研究者指出，被兩種名為CTCF和RAD21轉(zhuǎn)錄因子定義的標(biāo)記可以在基因的3’端進(jìn)行結(jié)合，盡管在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)不同，但特殊標(biāo)記可以使得基因更有可能發(fā)生重組。

上述研究結(jié)果在很大程度上同2013年斯克利普斯研究所科學(xué)家Ann Feeney進(jìn)行的研究相似，Ann Feeney的研究同樣也在V基因的使用中提及了轉(zhuǎn)錄因子CTCF和RAD21，然而研究者zui終并沒有鑒別出一種簡單的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。Feeney說道，目前沒有一個(gè)參數(shù)可以表明直接的線性關(guān)聯(lián)，這并不是說如果我們有特殊的組蛋白標(biāo)記，我們就可以獲得較多的重排組合。

研究者Corcoran說道，VDJ-Seq技術(shù)僅僅是所謂的整套測序（repertoire sequencing）策略中的一種，但其卻提供了兩種關(guān)鍵的優(yōu)勢，*，VDJ-Seq不像其它方法，其可以對DNA測序而并不是RNA，盡管重組通常發(fā)生于DNA中，我們?nèi)匀恍枰獙?shí)驗(yàn)來直接定量地觀察，從而發(fā)現(xiàn)一系列影響，包括產(chǎn)生VFJ事件的V基因之間的差異，V基因增強(qiáng)子以及RNA的穩(wěn)定性等，其它的優(yōu)勢就是VDJ-Seq不會(huì)在覆蓋V基因的區(qū)域出現(xiàn)偏差，而且VDJ-Seq并不依賴一系列V基因啟動(dòng)子。

一個(gè)關(guān)于架構(gòu)的問題

研究者Kenter從體系結(jié)構(gòu)的角度解析了免疫球蛋白重鏈區(qū)域的奧秘，通過利用此前存在的HiC數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白重鏈區(qū)域（lgh）位于名為拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）的隔絕的染色體附近區(qū)域，隨后研究者利用高分辨率方法（5C）以及3-D熒光原位雜交（DNA FISH）揭示了lgh的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上包含有三種不同的亞結(jié)構(gòu)域或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，每一種都和近段、中間及遠(yuǎn)端的V基因家族相對應(yīng)，而且每一種都將其轉(zhuǎn)角區(qū)域鑲嵌到了CTCF及其它的B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)處，這些轉(zhuǎn)錄因子就可以“停泊”架構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

如今研究者想知道是否這些特殊的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)影響V基因的利用（使用），他們已經(jīng)將位點(diǎn)壓縮同環(huán)狀結(jié)構(gòu)了其它，研究者Kenter解釋道，我們需要理解是否這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以幫助確定V基因的利用。對于研究者Corcoran而言，他們目前正在深入研究來確定新鑒別出的機(jī)制是否會(huì)影響人類機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)。

zui后研究者Feeney說道，免疫球蛋白基因位點(diǎn)就是一種動(dòng)態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)，在每一個(gè)B細(xì)胞中，其都會(huì)發(fā)生不同的變化，而且免疫球蛋白基因位點(diǎn)會(huì)發(fā)生改變，否則我們機(jī)體就不會(huì)產(chǎn)生多樣化的體系，因此我們或許并不會(huì)驚訝地發(fā)現(xiàn)多個(gè)因子會(huì)影響整個(gè)機(jī)體過程，而且還是在多個(gè)不同水平下影響的，我認(rèn)為這只是多種驅(qū)動(dòng)力組合所引發(fā)的結(jié)果。