近年來，合成生物學(xué)的研究如火如荼地開展，其目的在于構(gòu)建人工分子生物系統(tǒng)并執(zhí)行定制的功能。
來自湖南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)使用DNA分子反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)封裝在原生細(xì)胞中，以此構(gòu)建了一種可以持續(xù)處理生物環(huán)境中波動(dòng)生物信息的分子CPU(mCPU)，該研究成果發(fā)表于國(guó)際期刊Science Advances(IF=14.96)。原生細(xì)胞(protocell)的合成是該領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)，下文為此研究團(tuán)隊(duì)中的王老師分享的一些相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。
1合成原理
原生細(xì)胞的特點(diǎn)是含有微米級(jí)大小的空腔和外部的雙層磷脂膜。本論文采用反相微乳液方法制備人工的原生細(xì)胞，其特點(diǎn)是幾乎可以封裝任何物質(zhì)，包括蛋白，核酸和微納顆粒，并可以此定制用戶定義的分子生物系統(tǒng)。
該方法首先將小體積的水溶液加入到大體積(至少10倍)的磷脂油相中，制成大量油包水的乳液，即單層的微米級(jí)腔室。然后將該乳液滴入到含有單層磷脂的水相中，即可獲得雙層磷脂的原生細(xì)胞。其中，封裝的物質(zhì)均溶解在小體積的水溶液中。
2合成步驟
準(zhǔn)備油相
首先將儲(chǔ)備溶液(溶解在10 μL CHCl3 中的50 mg/mL 磷脂溶液POPC)completely干燥。然后加入 1 mL 礦物油以溶解脂質(zhì)膜，如 1.5 mL Eppendorf 管A，通過在 85°C 下孵育直到不再可見未溶解的 POPC。
準(zhǔn)備水相
將所需的 DNA 鏈溶解在含有 5 mM Mg2+的 280 mM 蔗糖中，作為B管中的內(nèi)部水相。C管是500μL含有單層磷脂的外部水相，由含有 5 mM Mg2+的DPBS 或280 mM葡萄糖，并在水相頂部加入200 μL POPC溶液。
制備乳液
將 20 μL 內(nèi)溶液移液到 400 μL 油包脂質(zhì)中，然后在水浴中超聲處理 30 至 60 分鐘以形成油包水乳液。
制備原生細(xì)胞
將乳液在室溫下平衡 2 分鐘并覆蓋在管 C 的界面溶液上，然后在離心機(jī)中靜態(tài)孵育 5 分鐘。通過以 5000g 離心 5 分鐘，獲得底部的原生細(xì)胞，并在 4 °C 下儲(chǔ)存。
3注意事項(xiàng)
重點(diǎn)難點(diǎn)1
高濃度的磷脂溶液需要completely干燥，最好在小容量的玻璃瓶中旋蒸，使之鋪成一層的白色薄膜。否則后期很難thorough溶解，會(huì)形成大量團(tuán)絮狀的油相雜質(zhì)。為此，后續(xù)的礦物油溶解和乳液形成過程中必要時(shí)可以超聲。
重點(diǎn)難點(diǎn)2
從乳液到原生細(xì)胞的過程中，很多人無(wú)法通過離心獲得沉淀產(chǎn)物。因?yàn)閮?nèi)部水相和外部水相沒有形成密度差，本文采用的是280 mM蔗糖溶液作為外部水相，280 mM 葡萄糖溶液或DPBS作為內(nèi)部水相。值得一提的是，在兩者形成密度差的同時(shí)，需要保持滲透壓相同以防止原生細(xì)胞破裂。
經(jīng)過本文實(shí)驗(yàn)，280 mM蔗糖溶液與DPBS滲透壓相同，均等同于生理?xiàng)l件下的滲透壓285-305 mOsm/kg，因此該原生細(xì)胞可以在生理?xiàng)l件下與自然細(xì)胞相互作用。
管B的乳液加入到管C的外部水相中需要一段時(shí)間的靜態(tài)平衡，使得單層磷脂的乳液充分接觸單層油水界面。
以上為王老師原生細(xì)胞合成的經(jīng)驗(yàn)分享，希望對(duì)大家有所幫助。同時(shí)也歡迎更多老師參與文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)活動(dòng)，分享您的科研干貨和心得體會(huì)！
