Western及IP細(xì)胞裂解液使用操作指南

Western及IP細(xì)胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來(lái)裂解細(xì)胞，并獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低濃度Triton X-100， 低濃度sodium pyrophosphate等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

操作說明：（僅供參考）

對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

1. 融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除營(yíng)養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗）。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。 對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必須分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后在裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。

3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

4. 裂解液使用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入100μL裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150μL或200μL。每100萬(wàn)細(xì)胞用100μL本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細(xì)胞有所不同。

對(duì)于組織樣品：

1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。

2. 融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

3. 按照每20mg組織加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。）

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。

6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex是樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)試驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

注意事項(xiàng)：

1.為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復(fù)凍融?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。

2.裂解樣品的所有步驟都需要在冰上或4℃進(jìn)行。

3.本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用，不做其它用途。

4.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。