質(zhì)粒DNA的制備

    有多種分離質(zhì)粒的方法，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過(guò)濾法等。

    目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒DNA。這個(gè)方法主要包括培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開(kāi)及除去蛋白質(zhì)和RNA。

1.堿變性法質(zhì)粒提取的原理：

    根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。

    在pH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。

    通過(guò)冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，zui后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。

2.堿變性法提取質(zhì)粒的步驟：

（1）取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；

（2）加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）渦旋震蕩懸浮菌液。

（3）加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。

（4）加入150毫升冰冷的溶液III，（*29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸餾水至100毫升）顛倒離心管10次后，冰浴5分鐘。

（5）離心的上清液用*抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。細(xì)胞