1.氟化鈉、釩酸鈉和焦磷酸鹽經常用做磷酸酶抑制劑，而*抑制劑、亮肽酶素和苯甲基磺酰氟化物用做蛋白酶抑制劑。這種緩沖液里所用的抑制劑全部具有一定程度的毒性，使用時應該小心操作。這些抑制劑可能不足以抑制所有蛋白的酶修飾，同時如果不需要的話也可將它們去除或替代。

2.ProteinA是一個葡萄球菌屬的蛋白，它結合到抗體分子的保守位置，親和力決定于種屬和抗體的類型。有一個類似ProteinA的分子是ProteinG，可以用于不同的抗體類型。一個實用的選擇規(guī)律是將Pro-teinA用于兔來源的抗體，而ProteinG用于鼠來源的抗體。在本章中，PAS可以是ProteinASepharose或 ProteinGSepharose。

3.除了用轉染的細胞，還可以用細胞系或組織表達的內源蛋白做免疫共沉淀。這樣做的優(yōu)勢是避免了過表達對細胞內環(huán)境的改變，并且消除了外來的接頭和標簽序列。然而，這類免疫共沉淀實驗將更加困難，因為需要細胞表達足夠多的內源性目標蛋白才能滿足高質量抗體的需要，并且實驗中缺乏好的陰性對照。本章列出的免疫沉淀過程可以作為一個實驗起始點，但是各種來源的細胞裂解物、各種抗體以及與種屬和匹配類型不相關的抗體應該被提前檢測是否能與感興趣蛋白發(fā)生特異性的相互作用。此外，如果蛋白相互作用可能被藥物的刺激或細胞的培養(yǎng)條件影響，那么應該在免疫共沉淀實驗中加以驗證。

4.這個方法中常用HEK293細胞，因為這種細胞易于培養(yǎng)并且轉染效率高。如果需要也可使用其他合適的細胞系。

5.除了數細胞個數，也可以用裂解物做蛋白濃度測量。如果樣品量大，這種做法非常方便。在免疫共沉淀時，用一種樣品的大約一半裂解物來作為其他樣品的等量對照，這樣各組容易獲得平均的蛋白量。

6.由于PAS的相對惰性以及Westernbloting對目標蛋白特異的檢測意味著在很多情況下，預清除步驟并不是必須的。為了節(jié)約時間和成本，實際實驗中經常將這步省略。但在*次嘗試一個特殊的免疫共沉淀時加上這步。

7.方法中列出的抗體和PAS的用量與細胞裂解物的量高度相關。這些量的選擇應該能夠zui大程度地沉淀誘餌蛋白。注意，大量的PAS更加容易沉淀復合體并能減少因為少量 PAS珠子流失所造成的影響。但是，這些試劑非常昂貴，所以在很多情況下可以盡量減少抗體和PAS的用量，用量對于不同系統(tǒng)有很大差異，應根據經驗選擇。

8.處理PAS應該注意一些技術。因為緩沖液可能會揮發(fā)，所以在從儲存瓶中取PAS珠子之前，應該先將瓶子平放并確認有幾乎等量的珠子和儲存緩沖液。如果儲存緩沖液變少了應該加入更多的儲存緩沖液（見包裝內描述）。在吸取懸濁液時，用開口較大的tip頭或將tip頭末端用刀片切掉。注意，離心很容易將PAS破壞，因此一定要用低速或者短時離心。在洗滌過程中，注意不要吸到珠子，也不要讓珠子干透。zui后，一次只準備足夠一次實驗的珠子，因為珠子長時間儲存在裂解緩沖液中會降低它與抗體的結合能力。

9.Westernblotingzui常用的IgG抗體是由兩條重鏈（大約50kD）和兩條輕鏈（大約25kD）組成的異源二聚體，重鏈與輕鏈依靠二硫鍵相連。當煮沸PAS收集感興趣的蛋白復合物時，大多數抗體將一起從珠子上洗脫，造成zui終樣品中有大量抗體蛋白污染。如果洗脫液中含有還原劑，抗體將幾乎都以50kD和25kD的條帶存在；如果沒有，它們將主要出現(xiàn)在150kD但是50kD和25kD蛋白依然非常顯著。這就成為標記Westernbloting的一個問題，因為Western的二抗通常是與過氧化物相連的抗IgG。如果免疫沉淀中的俘獲抗體和Western檢測用的一抗是同一種屬，被洗脫下來的俘獲抗體也能被二抗識別，這將產生非常強的干擾信號，因此免疫沉淀中的俘獲抗體和Western檢測的一抗應該選擇不同種屬的抗體。即使這樣，與抗體成分分子量相近的蛋白可能造成干擾，因為Western的二抗經常對不同種屬的IgG產生交叉反應。如果這個問題無法通過在洗脫液中加入或去除還原劑來克服，另外可能的解決辦法一是跑長一些PAGE膠使感興趣的蛋白與俘獲抗體在物理上分離，二是用共價交聯(lián)在珠子基質上的俘獲抗體。