使用濃度對(duì)熒光PCR結(jié)果的影響：ELISA試劑盒
SYBR Green I 的使用濃度是影響實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素，如果SYBR Green I的濃度不飽和會(huì)使熒光信號(hào)不能反應(yīng)產(chǎn)物量的變化。而過(guò)高濃度則會(huì)抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)效率。通常試劑盒會(huì)有比較現(xiàn)成的方案。提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用。在用SYBR Green I進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)， 鎂離子濃度要比無(wú)SYBR Green I 的普通 PCR 反應(yīng)要高(0.5-2mM)。
 
缺點(diǎn)：
然而雖然SYBR Green熒光染料可以用來(lái)監(jiān)測(cè)各種雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，靈活性高是它的優(yōu)點(diǎn)，但是正如一個(gè)硬幣有兩面，通用性高就意味著專一性低，由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此DNA引物二聚體(primer-dimers)或其它非特異擴(kuò)增產(chǎn)物(spurious PCR)可以對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生干擾(導(dǎo)致低Ct值)，同時(shí)也降低了反應(yīng)的專一性和可重復(fù)性---而這一點(diǎn)對(duì)于定量PCR分析十分重要。ELISA試劑盒
 
舍不得SYBR Green I的方便、通用、便宜的優(yōu)點(diǎn)，又希望提高其專一性，許多人做了不少嘗試：比如仔細(xì)的設(shè)計(jì)引物和純化模板、比如使用能分析產(chǎn)物熔解曲線的軟件可以解決引物二聚體的問(wèn)題選擇，還有就是采用嚴(yán)格熱啟動(dòng)的擴(kuò)增酶減少非特異擴(kuò)增、采用特定的緩沖系統(tǒng)減少引物二聚體和錯(cuò)配形成、采用修飾堿基減少二級(jí)結(jié)構(gòu)或者改變穩(wěn)定性、在Tm值以上進(jìn)行熒光測(cè)定減少引物二聚體的影響等等。提高PCR的特異性已經(jīng)是老大難問(wèn)題了，對(duì)于貪圖方便、便宜的實(shí)驗(yàn)新手來(lái)說(shuō)不一定能考慮周全，這也就是為什么許多希望能通過(guò)在普通PCR基礎(chǔ)上摸索條件，自己完成定量PCR檢測(cè)的研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)果不理想的主要原因之一。因此，不少生物技術(shù)公司針對(duì)熒光染料特異性缺點(diǎn)使出了各家的法寶，提出了有建設(shè)性和有新意的解決方案也讓這個(gè)熒光檢測(cè)技術(shù)繼續(xù)煥發(fā)光彩。ELISA試劑盒