實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒
試劑、試劑盒 LBNaOH*Tris·ClNaCl
儀器、耗材 硝酸纖維素濾膜離心機(jī)布氏漏斗培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 在含抗生素的平板上，通過系列等比稀釋確定質(zhì)粒和粘粒文庫的滴度，計(jì)算出*的鋪平板用的細(xì)菌懸液量并稀釋到5~10 ml LB培奍基中。
2. 準(zhǔn)備一層無菌的10 cm 或15 cm的Whatman 3 MM 濾紙，故在玻璃布氏漏斗或瓷質(zhì)過濾漏斗中，加入10~20 ml LB培養(yǎng)基。
3. 將標(biāo)記好方向的硝酸纖維素濾膜放入含抗生素的LB平板中，并移至過濾裝置，再將細(xì)菌懸液用吸管加到濾膜上，注意不要往濾膜邊緣4~5 mm 處加液體。
4. 慢慢抽吸液體，待菌懸液被吸干之后，揭下濾膜并移至含抗生素的平板中，置于37℃培養(yǎng)，直至長出直徑達(dá)1~2 mm 的菌落。
5. 標(biāo)記并浸濕另一張硝酸纖維素濾膜。
6. 先將長有克隆的濾膜（細(xì)菌面朝上）放在幾張20 cm×20 cm Whatman 3MM 濾紙上。
7. 戴上手套把浸濕的硝酸纖維素濾膜按標(biāo)記好的位置覆蓋到長有細(xì)菌的膜上，膜于膜之間錯開2~3 mm，以便于濾膜之間的分離。
8. 在硝酸纖維素膜上覆蓋3張20 cm×20 cm 的3 MM 濾紙，并同樣大小的玻璃平板壓在其上，轉(zhuǎn)印克隆。
9. 移去壓在濾膜上的玻璃平板和濾紙，用20-G針頭在重疊的原濾膜和轉(zhuǎn)印膜上刺一小孔以標(biāo)記方向。
10. 然后將它們分開，有菌落的一面朝上分別放入瓊脂平板中生長，轉(zhuǎn)印膜 于37℃培養(yǎng)，原濾膜則于25℃培養(yǎng)。
11. 主瓊脂平板保存于4 ℃，或繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)。
12. 將濾膜轉(zhuǎn)栘到含50 μg/ml *的LB平板上，37s℃培養(yǎng)4~10 h，以擴(kuò)增粘粒和質(zhì)粒。
13. 接著，濾膜轉(zhuǎn)印面朝上，依次放在3張分別飽蘸下面3種液體的46 cm×75 cm 3MM Whatman濾紙上5 min。
（1）0.5 mol/l NaOH
（2）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
（3）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5 / 1.25 mol/l NaCl
14. 用3 MM 濾紙將濾膜吸干后于80℃真空烤爐干烤90 min。
15. 采用切口平移標(biāo)記的探針與濾膜作雜交實(shí)驗(yàn)。
會員1.png)