實(shí)驗(yàn)方法原理 本試劑盒采用*的細(xì)胞裂解和相分離技術(shù)，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到純化基因組DNA 的目的。適合于從1.0×109 細(xì)菌中獲得多至20 μg 的基因組DNA。用于PCR、Southern 印跡分析、RAPD、RFLD 等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)菌培養(yǎng)物
試劑、試劑盒 細(xì)菌基因組DNA試劑盒
儀器、耗材 DNA 制備管小量濾器離心管
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
1. 說明書，耗材：DNA 制備管，小量濾器，2 ml 離心管，1.5 ml 離心管。
2. RNase A：50 mg/ml，室溫保存。
3. *：50%甘油溶解*，使*濃度為50 mg/ml，-20℃密閉貯存。
4. Buffer S：細(xì)菌原生質(zhì)制備液，加入RNase A 后，4℃密閉貯存。
5. 0.25M EDTA：室溫密閉貯存。
6. Buffer G-A：裂解液，室溫密閉貯存。
7. Buffer G-B：蛋白去除液，室溫密閉貯存。
8. Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液，請(qǐng)參照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存。
9. Buffer DV：相分離液，室溫密閉貯存。
10. Buffer BV：DNA 結(jié)合液，室溫密閉貯存。
11. Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
12. Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前按試劑瓶上的體積加入無水乙醇并混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇。
13. Eluent ：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. *次使用時(shí)，在Buffer W2 中按試劑瓶上的體積加入無水乙醇并混合均勻。
2. 準(zhǔn)備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 異丙醇，75 ml 異丁醇，加入提供的250 ml 試劑瓶中，混合均勻。
3. 4℃預(yù)冷Buffer DV。
4. *次使用試劑盒時(shí)，用50%甘油溶解*，使*濃度為50 mg/ml。
5. *次使用試劑盒時(shí)將隨試劑盒攜帶的RNase A 全部加入Buffer S 中，混合均勻。
6. 準(zhǔn)備65℃水浴。
7. 檢查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否出現(xiàn)沉淀，若出現(xiàn)沉淀，于65℃水浴加熱至沉淀*溶解后再使用。
8. 將Eluent 或去離子水加熱至65℃有利于基因組DNA 的充分洗脫。
三、操作步驟
1. 用2 ml 離心管收集1.0×109（1 ml 菌液OD600 為1-1.5）的細(xì)菌培養(yǎng)物，12 000×g 離心30 s，棄盡上清。用150 μl 已加入RNase A 的Buffer S 懸浮沉淀。
* 確認(rèn)RNase A 已加入Buffer S 中。
* 懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊，否則將影響溶菌效果。
2. 加入20 μl *貯存液，混合均勻，室溫靜置5 min。
3. 加入30 μl 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均勻，冰浴5 min。
4. 加入450 μl Buffer G-A,旋渦振蕩15 s，65℃水浴10 min。
5. 加入400 μl Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃預(yù)冷），用力混合，12 000×g 離心2 min。
* 請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前按照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備步驟2 內(nèi)容，準(zhǔn)備Buffer DV。
6. 盡可能丟棄上相，保留相間沉淀和下相。加入1 ml 4℃預(yù)冷Buffer DV，用力混合，12 000×g 離心2 min。
7. 丟棄上相，將下相轉(zhuǎn)移至濾器（濾器置于2 ml 離心管中）。12 000×g 離心1 min。
* 上相無需*棄盡，在轉(zhuǎn)移無色下相時(shí)偶有混入的上相，可在Tip 頭內(nèi)迅速分相，便于丟棄。
* 如在轉(zhuǎn)移過程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可過濾除去。
* 有色上相務(wù)必除盡，否則將抑制DNA 結(jié)合到silica 膜上。
8. 棄濾器，在濾液中加入400 μl Buffer BV，混合均勻。
步驟9-12 可選擇離心法或負(fù)壓法
A. 負(fù)壓法
9A. 將制備管插到負(fù)壓裝置的插口上，將步驟8 中的混合液移入制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-20-30 英寸汞柱，吸盡管中溶液。
10A. 保持負(fù)壓，加入500 μl Buffer W1，吸盡管中溶液。
11A. 保持負(fù)壓，沿管壁四周加入700 μl Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 μl BufferW2 洗滌一次。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
* 沿管壁四周加入Buffer W2 有助于*沖洗沾附在管壁上的鹽份。
* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被*清除，消除對(duì)酶切反應(yīng)的影響。
12A. 將制備管置于一個(gè)2 ml 離心管中，12 000×g 離心1 min。
B. 離心法
9B. 將制備管置于2 ml 離心管中，將步驟8 中的混合液移入制備管中，12,000×g 離心1 min。
10B. 棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入500 μl Buffer W1，12 000×g 離心1 min。
11B. 棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入700 μl Buffer W2，12 000×g 離心1 min。
以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被*清除，消除對(duì)酶切反應(yīng)的影響。
12B．棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，12 000×g 離心1 min。
13. 將制備管置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中，在silica 膜*加100-200 μl Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min。12 000×g 離心1 min 洗脫DNA。
* 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。
收起
注意事項(xiàng)
1. Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服、謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。
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