實(shí)驗(yàn)材料 DNA
試劑、試劑盒 Trish·CldNTPMgCl2BSADTT
儀器、耗材 水浴鍋
實(shí)驗(yàn)步驟
一、50 μl 反應(yīng)體積：
（1）50 mmol/l Tris·Cl，pH8.0
（2）5 mmol/l MgCl2
（3）5mmol/l DTT
（4）100 μmol/l 4dNTP混合液
（5）50 μg/ml BSA
（6）0.1 U T4DNA聚合酶
（7）2 μg DNA
（8）11℃溫育20 min，加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加熱10 min以終止反應(yīng)。
（9）反應(yīng)體枳、4種dNTp的濃度、反應(yīng)溫度可依具體應(yīng)用而變。
二、dNTp濃度的效應(yīng)
1. 高濃度的dNTP在通常實(shí)驗(yàn)下可以增加聚合酶活性對(duì)外切酶活性的比值。
2. 在標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)記了dNTP的濃度降至1到2 μmol/l，但標(biāo)記dNTP不能低于1 μmol/l 濃度，否則當(dāng)dNTP耗竭時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其外切酶活性對(duì)的降解。
三、度的效應(yīng)
用T4 DNA聚合酶標(biāo)記3’末端時(shí)，反應(yīng)溫度保持在11℃，在較髙溫度下，其外切酶活性易降解DNA模板。
收起
其他
一、緩沖系統(tǒng)的相容性
許多限制性內(nèi)切酶能在T4 DNA聚合酶的緩沖系統(tǒng)進(jìn)行切割反應(yīng)，同時(shí)，T4 DNA 聚合酶也能直接使用。
二、應(yīng)用
1. 放射性標(biāo)記DN段的3’末端，含5’凸出端的DN
段及濃度為1~2 μmol/l 的適當(dāng)［α-32P］dNTP，在11℃溫育20 min。
2. 選擇性及無(wú)選擇標(biāo)記線性化雙鏈DNA分子的3’宋端，即所謂的“置換合成"。雙鏈 DN
段在dNTP存在下與T4 聚合酶溫育，其3’末瑞的外切酶活性導(dǎo)致從 3’末端降解DNA，當(dāng)補(bǔ)加4種dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA鏌板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板時(shí)加入4種dNTP混合液，可獲得zui隹標(biāo)記效果。
3. 變雙鏈DNA的粘性末端成平端，便于平端克隆。在髙濃度4dNTP種存在下，酶促的 降解終止于雙鏈區(qū)，類(lèi)似地，如果末端存在5‘凸出，酶將延伸凹進(jìn)陷的3’端直至與5’端平齊。在實(shí)際應(yīng)用中，DNA與T4 DNA聚合酶和濃度各100 μmol/l dNTP在溫育20 min。
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