胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
測定意義：
ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸，同時還原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是細(xì)胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種 NADPH 重要來源，在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化。
測定原理：
利用 ICDHc 催化 NADP+還原成 NADPH 反應(yīng)，在 340 nm 下測定 NADPH 濃度的增加。
所需的儀器和用品:
紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，4℃保存；用時每支加 550μL 蒸餾水充分溶解備用；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；用時每支加 550μL 蒸餾水充分溶解備用；
樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑一置于 37℃(哺乳動物)或 25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱 10min 左右。3、操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 |
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試劑一 | 750 |
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試劑二 | 10 |
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試劑三 | 10 |
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樣本 | 30 |
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將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，加樣本的同時開始計時；混勻，在 340nm 波長下記錄 20s 時的初始吸光度 A1 和 2min20s 時的吸光度 A2，計算ΔA=A2-A1。
注意事項：
1、若 A2-A1 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，使 A2-A1 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
2、若 A2-A1 小于 0.5，可延長反應(yīng)時間到 5min 或 10min。
ICDHc 活力單位的計算：
1、血清（漿）ICDHc 活力的計算:
單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
ICDHc（U/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=2143×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 ICDHc 活力的計算:（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
ICDHc（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=2143×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
ICDHc（U/104）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=4.285×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，8×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
