基因組測(cè)序讓我們意識(shí)到，人類(lèi)基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質(zhì)。其實(shí)我們基因組的80%會(huì)轉(zhuǎn)錄成RNA，但這些轉(zhuǎn)錄本大多不生成蛋白質(zhì)。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA往往與人類(lèi)疾病有關(guān)，不過(guò)絕大多數(shù)非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。

CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始使用CRISPRa和CRISPRi，但它們其實(shí)還剛出爐不久。

zui近The Scientist雜志聯(lián)合CRISPR的和使用者共同編寫(xiě)了使用CRISPRa和CRISPRi的入門(mén)指南，幫助研究者們更好的研究和調(diào)節(jié)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。

如何進(jìn)入細(xì)胞

把Cas9蛋白送入細(xì)胞并不是一件容易的事，尤其是CRISPRi和CRISPRa中的改良Cas9。對(duì)于CRISPRa來(lái)說(shuō)，構(gòu)建始終表達(dá)Cas9或誘導(dǎo)表達(dá)Cas9的突變小鼠可以解決這個(gè)問(wèn)題。此外，截短的引導(dǎo)RNA也不難進(jìn)入小鼠。14或15bp的引導(dǎo)RNA能包裝進(jìn)病毒（腺相關(guān)病毒AAV更好），進(jìn)而注射到小鼠體內(nèi)。這種短RNA不能使Cas9剪切DNA，但可以招募轉(zhuǎn)錄激活子。

事實(shí)上研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了更小的Cas9。過(guò)去我們常用的是釀膿鏈球菌Cas9，其實(shí)*Cas9要小得多，可以包裝到AAV并進(jìn)入細(xì)胞。雖然*Cas9靶標(biāo)的位點(diǎn)要少一些，但對(duì)于轉(zhuǎn)錄激活來(lái)說(shuō)這并不是什么大問(wèn)題。

測(cè)試多少引導(dǎo)RNA

與編輯蛋白編碼基因所用的sgRNA（約20nt）相比，研究非編碼RNA需要測(cè)試更多的sgRNA。Bassett進(jìn)行基因編輯的時(shí)候通常設(shè)計(jì)三個(gè)引導(dǎo)RNA，但在CRISPRi中他會(huì)準(zhǔn)備5-20個(gè)引導(dǎo)RNA。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)*–200bp的區(qū)間中，我會(huì)盡可能多的嘗試。預(yù)測(cè)脫靶效應(yīng)的計(jì)算工具可以幫助我們縮小引導(dǎo)RNA的選擇范圍。

用CRISPRa研究非編碼RNA需要測(cè)試的sgRNA就更多了，因?yàn)槠珢?ài)非編碼轉(zhuǎn)錄本的sgRNA并不那么好找?？赡芪覀兯霓D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)對(duì)非編碼RNA來(lái)說(shuō)并不是那么合適。也可能非編碼RNA就是更難激活。