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昨日，在 Nature Methods 同時刊登的兩篇研究中，發(fā)表了兩種分析 CRISPR/Cas- 9 基因組編輯脫靶效應(yīng)的新方法。其中一種方法可以鑒定細(xì)胞類型特異性 SNP 相關(guān)的脫靶突變，另一種則可以檢測潛在脫靶切割位點(diǎn)。

*項(xiàng)研究中，來自麻省綜合醫(yī)院（MGH）和哈弗大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種通過測序體外檢測切割效應(yīng)的方法，稱作 CIRCLE-seq，該方法是一種高度靈敏的體外篩查法，比現(xiàn)有識別 CRISPR/Cas9 全基因組脫靶突變的細(xì)胞學(xué)或生化方法更有效。

“與之前的體外方法不同，我們所展示的 CIRCLE-seq 可以使用下一代測序技術(shù)，并且不需要參考基因組序列。”作者在文章提到，“更重要的是，CIRCLE-seq 可以用來識別與細(xì)胞類型特異性 SNP 相關(guān)的脫靶突變，進(jìn)而證明個性化的特異性分析的可行性和重要性。CIRCLE-seq 提供了一種快速、全面可行的識別全基因組范圍 CRISPR/Cas9 脫靶突變的方法。”

研究人員檢測了新方法的靈敏性，將靶向 HBB 基因的 sgRNA 的脫靶結(jié)果與利用另一種方法 Digenome-seq 識別的脫靶結(jié)果進(jìn)行比較。他們發(fā)現(xiàn) CIRCLE-seq 鑒定出了 Digenome-seq 已檢測到的 29 個位點(diǎn)中的 26 個，并且還檢測到 156 個其他方法無法檢測的新位點(diǎn)。

研究人員表示，“這些結(jié)果表明，與 Digenome-seq 檢測到的結(jié)果相比，CIRCLE-seq 具有更高的信噪比，而且使用的測序 reads 減少了一百倍，這可能是由于該技術(shù)在識別全基因組范圍脫靶位點(diǎn)方面具有更高的靈敏度。”

第二項(xiàng)研究中，來自馴鹿生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室和美國杜邦公司的研究人員描述了一種生化方法，稱作 SITE-Seq，該技術(shù)使用了 sgRNA 編程的 Cas9 對基因組 DNA 中的剪切位點(diǎn)序列進(jìn)行識別。

“我們使用 SITE-Seq 檢測靶向人類基因組的 sgRNA 與 Cas9 的特異性。識別的位點(diǎn)數(shù)量依賴于 sgRNA 序列和核苷酸濃度。低濃度條件下鑒定到的位點(diǎn)更有可能是細(xì)胞中的脫靶突變。”研究小組說，“細(xì)胞中具有活性的脫靶位點(diǎn)會受到 sgRNP 傳遞、細(xì)胞類型和在核苷酸環(huán)境接觸的持續(xù)時間影響。總而言之，我們的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在評估核苷酸活性和特異性時，將全面的脫靶位點(diǎn)生化識別方法與基于細(xì)胞的活性檢測方法結(jié)合的有效性。”

SITE-Seq 過程包括了選擇性的標(biāo)記、富集、測序，以及將將切割后的基因組 DNA 與對應(yīng)的參考基因組比對。zui終比對結(jié)果中，sgRNP 切割產(chǎn)生的位點(diǎn)會生成一個特殊的信號，可以通過計算檢測，研究人員還表示，這個信號與 Digenome-seq. 檢測到的信號相似。

此外，研究人員在 Cas9 消化處理的人類胚腎基因組 DNA 中檢測了該方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn) SITE-Seq 靶向的 771 個生化切割位點(diǎn)。研究人員接下來將 AAVS1 sgRNA 轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá) Cas9–GFP 的 HEK293 細(xì)胞中，3 天后進(jìn)行脫靶編輯。他們從zui初的 771 個包含大范圍核苷酸替換的位點(diǎn)中選擇了 68 個位點(diǎn)進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn) 29 個細(xì)胞脫靶位點(diǎn)的突變頻率在 0.1%~66.6%。

研究小組在文章提到，“綜合考慮，這些數(shù)據(jù)表明 SITE-Seq 可以確保檢測到所有的 sgRNP 生化切割位點(diǎn)，進(jìn)而定位這些在細(xì)胞環(huán)境中積累了脫靶突變的靶點(diǎn)。”