關(guān)于設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對(duì)siRNA功能的影響，至今還沒有可靠的規(guī)律。雖然我們可以通過對(duì)mRNA實(shí)驗(yàn)分析準(zhǔn)確的找到一段基因的全部siRNA*作用位置，但這個(gè)過程十分耗時(shí)且昂貴，不推薦常規(guī)實(shí)驗(yàn)使用。一種做法是每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3-4對(duì)siRNAs，實(shí)驗(yàn)選擇較有效的siRNA。

方法一、根據(jù)Tuschl的實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)要點(diǎn)

目前，siRNA設(shè)計(jì)大都根據(jù)Tuschl的實(shí)驗(yàn)，要點(diǎn)如下：

1.目標(biāo)基因開放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列后的19個(gè)堿基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19個(gè)堿基序列同樣可以得到很好效果的siRNA）。 設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5' 和3' 端的非編碼區(qū)。

2.分析獲得的序列，選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優(yōu)選。

3.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。

4.如果您選擇shRNA，有報(bào)道顯示9個(gè)寡核苷酸的環(huán)是zui有效的。

方法二：

1.  從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3' 端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5' 和3' 端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

2.  將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST

3.  選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。

負(fù)對(duì)照

一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對(duì)照，作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。 如果計(jì)劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個(gè)堿基序列，廠家會(huì)合成一對(duì)互補(bǔ)的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因?yàn)檫@個(gè)突出端無需和靶序列互補(bǔ)。

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