谷研試劑-SPA夾心ELISA試驗(yàn)檢測(cè)CIC

*A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)可與IC中IgG的Fc段結(jié)合。將待測(cè)血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上，再以酶標(biāo)記的SPA與之反應(yīng)，即可檢測(cè)樣本中有無IC。

    (一)試劑

    1．5％與2．5％PEG用0．02mol/LpH7．4PBS配制。

    2．牛血清白蛋白(BSA)緩沖液：用0．05mol/L pH 7．4PBS配制。含0．01mol/L EDTA、0．1％硫柳，0．05％Tween 20，4％BSA。

    3．HRP—SPA用改良過碘酸鈉法將SPA與辣根過氧化物酶(HRP)制成結(jié)合物。zui適工作濃度以方陣法滴定。

    4．熱聚合人IgG：人IgG 10mg/mL，63℃加熱20min制成。

 (二)操作步驟

 1．用PBS稀釋SPA成5Ps/mL，包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，每孔0．1mL(對(duì)照孔不包被)，置4℃過夜后洗滌3次備用。

     2．待測(cè)血清0．05mL加PBS0．15mL和5％PEG0．2mL混勻，4℃過夜后1 600r/min離心20min，棄上清，沉淀用2．5％PEG洗2次，加入PBS0．2mL和BSA緩沖液0。2mL，混勻，置37℃水浴30min，搖動(dòng)，使*溶解。

    3．將已溶解的待測(cè)血清沉淀物加至上述包被孔和對(duì)照孔中，置37℃ 60min，洗3次；各孔加底物溶液(OPD—H₂0₂)0．1mL，37C 20min使呈色。每孔加2mol/LH₂S0₄1滴終止反應(yīng)。置酶標(biāo)儀492nm測(cè)各孔吸光值。

    4．標(biāo)準(zhǔn)曲線制備  取正常人血清0．2mL，加熱聚合人IsC(120ug/mL)0．2mL，再加PBS0．4mL和5％PEG0．8mL，置4℃過夜。同時(shí)做不加熱聚合人耽的正常血清對(duì)照，以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標(biāo)本操作。用稀釋的BSA緩沖液(加等量0．01 mol/LpH7．4PBS)1．6mL溶解并稀釋成120、60、30、15、7．5ug/mL，與待測(cè)血清同法操作，制成工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5．結(jié)果判斷  從待測(cè)血清吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可換算成相當(dāng)于熱聚合人IgG的CIC含量(ug/ml)。以高于正常對(duì)照X+2S，即大于28．4ug/mL為陽性。

(三)注意事項(xiàng)

1．熱聚合人IgC應(yīng)分裝貯存于—20℃，不宜反復(fù)凍融，否則易解聚。

2．PEG的濃度影響CIC沉淀量，須嚴(yán)格配制。