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植物葉片葉綠體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書
主要用途
植物葉片葉綠體粗提分離試劑是一種旨在通過(guò)物理破壁和化學(xué)破膜及離心處理方法，從植物葉片組織中分
離出完整而純化的葉綠體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合
于菠菜、豌豆、萵苣、卷心菜、甜菜、煙草等各種新鮮植物葉片（leaf）組織，同時(shí)也適用于植物谷粒（grain）、
種子（seed）等葉綠體成分的分離。用于高等植物不育性、葉綠體功能和活性、遺傳等研究。產(chǎn)品即到即
用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，無(wú)核酶和蛋白酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。
技術(shù)背景
葉綠體（chloroplast）是綠色植物進(jìn)行光合作用和能量轉(zhuǎn)化的重要細(xì)胞器。葉綠體是細(xì)胞質(zhì)中的一種色素體，
因含葉綠素而成綠色。葉綠體由外被（envelope）、類囊體（thylakoid）和基質(zhì)（stroma）組成。葉綠體DNA
是一種閉合環(huán)狀雙股結(jié)構(gòu)，含有10至30個(gè)基因，編碼200個(gè)蛋白質(zhì)。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
凈化液（Reagent C） 毫升
強(qiáng)化液（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書1 份
保存方式
保存凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6 月
用戶自備
15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
50 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于保存葉綠體樣品
尼龍絲或60 微米尼龍網(wǎng)：用于去除植物裂解殘?jiān)?/span>
小型漏斗：用于過(guò)濾的裝置
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞
渦旋震蕩儀：用于混勻
實(shí)驗(yàn)步驟
一、物理勻漿法
實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出xx 毫升凈化液（Reagent C）和xx 毫升
的裂解液（Reagent B）到15 毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)
行下列操作。
1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物葉片組織，并秤重以確定1 克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 用刀片切碎組織（注意：建議去除葉莖）
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的xx 毫升裂解工作液
7． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
9． 置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80 下）（注意：參見注意事項(xiàng)9）
10．（選擇步驟）準(zhǔn)備1 個(gè)小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60 微米尼龍網(wǎng)，置于50 毫升錐形離心管上
11．（選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過(guò)濾（注意：可以使用4 層紗布替代）
12．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為200g
13．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（如果跳過(guò)過(guò)濾步
驟或上清液含有肉眼可見的殘?jiān)?，重?fù)離心5 分鐘一次，速度為200g）——此步驟去除細(xì)胞壁殘?jiān)?/span>
細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
14．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為1000g
15．小心抽去上清液，保留綠色沉淀顆粒，避免光照——此步驟獲得葉綠體沉淀物
16．加入xx 微升保存液（Reagent E），充分混勻沉淀顆粒群
17．（選擇步驟）進(jìn)行葉綠素定量測(cè)定（建議使用植物葉綠體總蛋白定量檢測(cè)試劑盒）
18．即刻移入1.5 毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里保存
二、化學(xué)處理法
實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出xx 毫升凈化液（Reagent C）和xx 毫升
的裂解液（Reagent B）到15 毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)
行下列操作。
1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1 克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 移入一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15 毫升錐形離心管
8． 加入預(yù)冷的xx 毫升裂解工作液
9． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
10．在冰槽里孵育2 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒一次
3
11．加入預(yù)冷的xx 微升強(qiáng)化液（Reagent D）
12．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
13．在冰槽里孵育5 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)10）
14．加入預(yù)冷的xx 毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
15．（選擇步驟）準(zhǔn)備1 個(gè)小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60 微米尼龍網(wǎng)，置于50 毫升錐形離心管上
16．（選擇步驟）將所有組織裂解液移入到小型漏斗里過(guò)濾（注意：可以使用4 層紗布替代）
17．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為200g
18．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（如果如果跳過(guò)過(guò)
濾步驟或上清液含有肉眼可見的殘?jiān)貜?fù)離心5 分鐘一次，速度為200g）——此步驟去除細(xì)胞壁殘
渣、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
19．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為1000g
20．小心抽去上清液，保留綠色沉淀顆粒，避免光照——此步驟獲得葉綠體沉淀物
21．加入xx 微升保存液（Reagent E），充分混勻沉淀顆粒群
22．（選擇步驟）進(jìn)行葉綠素定量測(cè)定（建議使用植物葉綠體總蛋白定量檢測(cè)試劑盒）
23．即刻移入1.5 毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里保存
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次操作（1 克植物葉片組織）
2． 建議使用新鮮植物樣品，暗室4℃冰箱里過(guò)夜
3． 植物樣品務(wù)必避光，以防止淀粉聚集
4． 葉綠體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
5． 操作時(shí)，須無(wú)菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
6． 建議使用足夠的組織量
7． 建議植物組織使用物理法組織勻漿器操作為；德國(guó)的BRAUN 細(xì)胞勻漿器zui為理想
8． 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
9． 通常勻化次數(shù)為80 下（或組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織
類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3 微升勻漿物的組織細(xì)胞裂解程度：完整組織細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)
亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
10．通常孵育5 分鐘達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)
顯微鏡觀察3 微升裂解物的組織細(xì)胞裂解程度：完整組織細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵
育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
11．本公司提供系列植物葉綠體分析技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1、本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2、本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的葉綠體內(nèi)外膜完整
3、本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的葉綠體維持正常活性
4、本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶