材料

　　1. 淋巴細(xì)胞分離液 (比重1.077土0.001)。

　　2. 肝素。

　　3. 無Ca2+、Mg2+的Hanks溶液，pH7.2～7.6。

　　4. RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)。

　　5. 其它:注射器、吸管、滴管（均為無菌）,血球計數(shù)板，水平離心機(jī)，顯微鏡等。

　　方法

　　1. 無菌抽取靜脈血2ml，去掉針頭注人含有肝素的無菌試管中搖勻，加入2ml Hanks溶液進(jìn)行對倍稀釋，混勻。

　　2. 用吸管吸取稀釋血液沿試管壁緩緩加到含有2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管中（血液:Hanks液:淋巴細(xì)胞分離液的比例為1:1:1），沿管壁流下的稀釋血液疊加在分離液之上，并與分離液形成明顯的界面。

　　3. 經(jīng)水平式離心2000r/min×20min，小心取出試管。

　　4. 用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的淋巴細(xì)胞層，用Hanks溶液洗滌兩次，每次離心1500r/min×10min。

　　5. 棄上清，加RPMI-1640培養(yǎng)液1ml混勻，取少許進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及活力測定。

　　（1） 細(xì)胞計數(shù): 取1滴細(xì)胞懸液置血球計數(shù)板上，靜置片刻，顯微鏡下計數(shù)四角四個大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)（見圖15），按下列公式計算出細(xì)胞總數(shù)。

　　四個大方格細(xì)胞總數(shù) ×稀釋倍數(shù)×細(xì)胞懸液毫升數(shù)×104

　　細(xì)胞總數(shù) = 4

　　（2）臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力: 取4份0.2%臺盼藍(lán)與1份4.25%生理鹽水混合，將臺盼藍(lán)生理鹽水溶液與細(xì)胞懸液等量混合，在3分鐘之內(nèi)壓片，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)未染色的細(xì)胞（為活細(xì)胞）與染色細(xì)胞（染成蘭色,為死細(xì)胞），計算活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

　　活細(xì)胞數(shù) ×100%。

　　細(xì)胞存活率＝ 活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)

　　6. 后將淋巴細(xì)胞懸液用RPMI-1640培養(yǎng)液配成相應(yīng)的細(xì)胞濃度備用。

　　結(jié)果

　　在回收細(xì)胞分離液上界面的總細(xì)胞中單個核細(xì)胞應(yīng)占90%以上（同時細(xì)胞存活率應(yīng)大于90%），其中的粒細(xì)胞占0-5%，血小板小于0.5%，紅細(xì)胞占0-7%。

　　注意事項(xiàng)

　　1.抽血后在2小時內(nèi)使用。

　　2.注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在聚蔗糖液面上，避免破壞其界面。

3. 在收集單個核細(xì)胞時，將吸管輕輕插入單個核細(xì)胞層，沿管壁輕輕旋轉(zhuǎn)吸取細(xì)胞。